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【要点解析】gb4789.3-2016大肠菌群计数！
2023-09-08 17:09:02 点击量:
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大肠菌群定义：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上分类命名，它不代表某一种或某一属的细菌，而是一组与粪便污染有关的细菌。这群细菌包括：埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属、肠杆菌属（又叫产气杆菌属，包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌）和等。
卫生学意义：大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。表示了对人体健康是否具有潜在的危险性。直接反映了样品受粪便污染的的程度。
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1. 什么是mpn法？
•mpn法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
•mpn值并不能表示实际菌落数， 实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点，mpn值是落在这个置信区间内概率最大的一点。
•灵敏度较高，适用于污染菌落较少的样品。
2.大肠菌群mpn计数的检验操作
操作注意事项
1:建议用磷酸盐缓冲液作为稀释液，因为磷酸盐缓冲液能更好地纠正食品样品中ph变化，对细菌具有保护作用。
2:初发酵接种量超过1ml,则用双料lst肉汤。
3:培养基检查。加入样品前应观察导管内是否有气泡，若有，应适当倾斜试管，让气体排出。
4:结果观察。某些食品样品可能会堵塞小导管底部，影响导管内气泡的观察，可将试管微微倾斜，用手指轻弹管壁，观察是否有一串小气地沿管壁升起， 若有，则判定气。
3. 培养基原理解析
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（lst）
•月桂基硫酸盐能抑制革兰氏阳性菌生长，胰蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂。
•36±1℃培养24h后若已产气，则可停止培养。如果没有观察到有产气的现象，则继续培养至48±2h。
•如接种量超过1ml，则用双料lst肉汤。
煌绿乳糖胆盐肉汤（bglb）
•胆盐与煌绿均能抑制革兰氏阳性菌生长。
•培养基配方当中含有胆盐，大肠菌群发酵乳糖所产的酸会与胆盐发生反应，形成胆酸沉淀。培养基可由原来的绿色变为黄色。
4. 大肠菌群最大可能数（mpn）报告
•确证的大肠菌群bglb阳性管数，检索mpn表，报告每1g(ml)样品中大肠菌群的mpn值。
•当实验结果在mpn表中无法查找到mpn值时，如：阳性管数为122，123，232，233等时，建议增加稀释度（可做4~5个稀释度），使样品最高稀释度能达到阴性终点(如果污染程度不能判定，则多加一稀释度），然后再遵循相关的规则进行查找，最终确定mpn值。
表:大肠菌群最可能数(mpn)检索表
|
阳 性 管 数 |
mpn |
95%可 信 限 |
阳 性 管 数 |
mpn |
95%可 信 限 |
||||||
|
0.10 |
0.01 |
0.001 |
下 限 |
上 限 |
0.10 |
0.01 |
0.001 |
下 限 |
上 限 |
||
|
0 |
0 |
0 |
<3.0 |
— |
9.5 |
2 |
2 |
0 |
21 |
4.5 |
42 |
|
0 |
0 |
1 |
3.0 |
0.15 |
9.6 |
2 |
2 |
1 |
28 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
0 |
3.0 |
0.15 |
11 |
2 |
2 |
2 |
35 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
1 |
6.1 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
0 |
29 |
8.7 |
94 |
|
0 |
2 |
0 |
6.2 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
1 |
36 |
8.7 |
94 |
|
0 |
3 |
0 |
9.4 |
3.6 |
38 |
3 |
0 |
0 |
23 |
4.6 |
94 |
|
1 |
0 |
0 |
3.6 |
0.17 |
18 |
3 |
0 |
1 |
38 |
8.7 |
110 |
|
1 |
0 |
1 |
7.2 |
1.3 |
18 |
3 |
0 |
2 |
64 |
17 |
180 |
|
1 |
0 |
2 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
0 |
43 |
9 |
180 |
|
1 |
1 |
0 |
7.4 |
1.3 |
20 |
3 |
1 |
1 |
75 |
17 |
200 |
|
1 |
1 |
1 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
2 |
120 |
37 |
420 |
|
1 |
2 |
0 |
11 |
3.6 |
42 |
3 |
1 |
3 |
160 |
40 |
420 |
|
1 |
2 |
1 |
15 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
0 |
93 |
18 |
420 |
|
1 |
3 |
0 |
16 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
1 |
150 |
37 |
420 |
|
2 |
0 |
0 |
9.2 |
1.4 |
38 |
3 |
2 |
2 |
210 |
40 |
430 |
|
2 |
0 |
1 |
14 |
3.6 |
42 |
3 |
2 |
3 |
290 |
90 |
1000 |
|
2 |
0 |
2 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
0 |
240 |
42 |
1000 |
|
2 |
1 |
0 |
15 |
3.7 |
42 |
3 |
3 |
1 |
460 |
90 |
2000 |
|
2 |
1 |
1 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
2 |
1100 |
180 |
4100 |
|
2 |
1 |
2 |
27 |
8.7 |
94 |
3 |
3 |
3 |
>1100 |
420 |
— |
|
注1:本 表 采 用3个 稀 释 度[0.1g(ml)、0.01g(ml)、0.001g(ml)],每 个 稀 释 度 接 种3管 。 注2:表 内 所 列 检 样 量 如 改 用1g(ml)、0.1g(ml)和0.01g(ml)时,表 内 数 字 应 相 应 降 低10倍;如 改 用0.01g(ml)、0.001g(ml)和0.0001g(ml)时,则 表 内 数 字 应 相 应 增 高10倍,其 余 类 推 。 |
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1. 大肠菌群平板计数法流程图
操作注意事项
1：平板法相对mpn法来说，结果更加直观精确。长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。适用于污染较为严重的样品。
2：从一个样品取样到倾注琼脂平板，应在15分钟内完成。
3：检验所用物品应无菌，无抑菌残留物。
4：bglb确血试验需从vrba平板上挑起至少10个典型和可疑菌落进行，如平板上菌落数少于10个，则挑取全部典型和可疑菌落进行验证。
2. 培养基原理解析
结晶紫中性红胆盐琼脂（vrba）
•配方中胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌，中性红作为指示剂，在酸性条件下为紫红色。
•大肠菌群分解乳糖所产的酸与胆盐结合，可形成粉红色菌落菌落周围有胆酸盐沉淀环。
•该培养基无需高温高压灭菌，现配现用。
3. 计数典型和可疑菌落数
结果判读：选取菌落数在15 cfu～150 cfu之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm或更大。
证实试验：从各样品中接种同一样品浓度的vrba平板上共挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于bglb肉汤管内，36℃±1℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡bglb肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
4. 大肠菌群平板计数的报告
•经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(ml)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1ml,在vrba平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种bglb肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(ml)=6.0×105cfu/g(ml)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
•若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则小于1乘以最低稀释倍数计算。
4
1. 实验室过程中，每批样品稀释液都要做空白对照。
2. 为了控制环境污染，每次检验过程中，于检验台上打开两块计数琼脂平板，并在检验环境中暴露不少于15分钟，将此平板与本批次样品同时进行培养，以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。
3. 定期使用大肠埃希氏菌atcc25922或相应定量活菌参考品，在p2实验室或阳性对照实验室内，用适当的食品样品进行阳性实验验证，并进行记录，次验证实验至少每2个月进行1次。
来源：环凯微生物